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■ 核酸質(zhì)量評分：DNA

通過計算基因組質(zhì)量評分（DQN），可以高效地評估gDNA的質(zhì)量。由Qsep開發(fā)用于片段分析儀，數(shù)據(jù)分析軟件評估每個樣品與用戶定義的特定應用閾值用于“高質(zhì)量的DNA”，并指定0到10之間的DQN值。數(shù)值反映高于定義的閾值的DNA的百分比。

圖1：不同DQN評分的基因組樣本

■ 核酸質(zhì)量評分：RNA

有兩個指標可用于評估RNA的質(zhì)量，軟件計算RNA質(zhì)量數(shù)（RQN），相當于RNA完整性數(shù)（RIN），RIN是廣泛接受的總RNA完整性和質(zhì)量指標。與RIN值類似，RQN值范圍為1到10， 是基于專有的計算算法，考慮RNA電泳圖譜的整個分布。

圖2：不同RQN評分的RNA樣品

盡管RIN / RQN值是從新鮮組織分離的RNA的質(zhì)量的可靠評價標準，但它們并不是降解福爾馬林固定的石蠟包埋（FFPE）樣品的RNA質(zhì)量的十分有效的評價標準。為了解決這個問題，Illumina的科學家開發(fā)了DV200這個檢測標準，它可以計算RNA片段大于200nt大小的百分比。考慮到DV200值和二代文庫產(chǎn)量之間的更強的相關(guān)性，與RQN值相比，DV200的評價對于評估FFPE RNA質(zhì)量是更為理想的。

圖3：不同DV200評分的FFPE RNA 樣品

■ 基因組DNA和FFPE DNA

使用DNA卡夾檢測所測樣品后，Qsep軟件可以自動準確地測定gDNA樣本的大小和DQN。

DNA在福爾馬林固定過程中經(jīng)歷了大量的化學修飾，包括與蛋白質(zhì)交聯(lián)和降解成較小的片段。從FFPE樣品中分離出的DNA質(zhì)量因固定方法和標本組織年齡的不同而有很大差異。使軟件中Smear功能可以對降解的FFPE DNA進行質(zhì)量評估（如下圖，以1k為閾值）。它們提供DQN值進行簡化的質(zhì)量評估，用于指導以下內(nèi)容：

1. 第一次擴增中使用的PCR循環(huán)次數(shù)

2. 打斷所用的條件

3. 文庫構(gòu)建的質(zhì)量

圖4：FFPE樣本檢測DQN情況對比

其后對這四個樣品進行分批次建庫，多批次結(jié)果均一致，對文庫用Qsep進行片段檢測，結(jié)果如下圖。

圖5：對應樣本的文庫質(zhì)控結(jié)果

如圖所示，質(zhì)量評分最低的最后一個樣本，所構(gòu)建文庫大小顯著偏小，引物二聚體殘留較多，此外文庫濃度也是4個文庫中最低，且多批次一致。因此文庫質(zhì)量的好壞除建庫方法和過程細節(jié)外，最重要的還是初始的樣本質(zhì)量。文庫質(zhì)量的高低也影響了后續(xù)測序的結(jié)果以及數(shù)據(jù)的結(jié)果，因此做好提取樣品的質(zhì)控是第一步，也是最關(guān)鍵的一步。

■ 建庫前樣品

在文庫構(gòu)建前對樣品進行片段打斷時可以對打斷的樣品進行一次質(zhì)控，用于檢測打斷的條帶是否滿足預期需求，以確定是否需要改變打斷的條件。

圖6：打斷樣品的檢測圖

可通過軟件Smear功能來確定片段的主要分布區(qū)間，以期得到最佳打斷打斷效果。

腫瘤液態(tài)活檢中游離核酸提取質(zhì)量的質(zhì)控也是目前相對比較熱門的方向，不少用戶使用Qsep系列來檢測cfDNA樣品，Qsep系列可以達到pg級的檢測靈敏度，對于cfDNA樣品的檢測相對輕松，可以準確測定樣品的目的區(qū)域和大片段核酸的分布比例。

圖8：cDNA樣品的檢測圖

圖8：文庫的片段分布檢測圖