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99% 的科研人都易忽視的核酸質(zhì)控關(guān)鍵點
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作者:201321492800086
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發(fā)布時間: 1370天前
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上圖的對話經(jīng)常出現(xiàn)在分子生物學(xué)實驗室中，提取是分子實驗的第一步，也是影響最終結(jié)果的最重要的因素之一，當然可能會有人不贊同，只是做簡單的PCR實驗，提取隨便做做就可以擴增出很亮的條帶。
文獻支持
好吧，那我們先從一篇文獻來看，文章作者研究了提取和文庫制備方法對糞便樣本中的生物多樣性的影響。最終發(fā)現(xiàn)對結(jié)果有顯著性影響是提取方法，最后提供了一種可復(fù)制的穩(wěn)定的提取方法。作者使用了21種提取方法，并且通過提取總量（ng）和質(zhì)量（片段大?。﹥蓚€方面對樣本質(zhì)量進行排列和對比。
圖1 提取DNA的質(zhì)量控制。
從21種不同方法中提取DNA 的質(zhì)量(a)和數(shù)量(b) 。(a)短于1.8kb的DNA分子百分比。(b)提取的 DNA量。
如圖1 所示，其中虛線作為質(zhì)量控制的關(guān)鍵點未能滿足質(zhì)量控制的方法用方框和紅色字體標注。其后作者用不同提取出來的樣品進行建庫測序分析。得到了不同的微生物豐度的數(shù)據(jù)。
圖2 物種豐度差異對比
如圖2所示，樣品1和樣品2 之間所有結(jié)果表現(xiàn)具有一致性，但整體跟提取質(zhì)量最好的五個樣品的平均值相比，革蘭氏陽性菌被嚴重低估，革蘭氏陰性菌雖有顯著差異，但整體變化不大。因此，在這里量化的所有因素中，DNA提取方案的變化對觀察到的微生物組成有最大的影響。也就是初始的DNA質(zhì)量對后續(xù)數(shù)據(jù)的結(jié)果影響十分之大。
實際案例
再說到實際案例當中，我們使用Qsep對不同質(zhì)量的FFPE基因組樣本進行了檢測，高質(zhì)量條帶以1k為界，通過儀器給出的不同DQN評分對FFPE樣本進行評價排序。如圖3所示。
圖3 Qsep不同降解程度FFPE 樣本檢測結(jié)果
其后對這四個樣品進行分批次建庫，多批次結(jié)果均一致，對文庫用Qsep進行片段檢測，結(jié)果如圖4。
圖4 對應(yīng)樣本的文庫質(zhì)控結(jié)果
如圖4所示，質(zhì)量評分最低的最后一個樣本，所構(gòu)建文庫大小顯著偏小，此外文庫濃度也是4個文庫中最低，且多批次一致。因此文庫質(zhì)量的好壞除建庫方法和過程細節(jié)外，最重要的還是初始的樣本質(zhì)量。文庫質(zhì)量的高低也影響了后續(xù)測序的結(jié)果以及數(shù)據(jù)的結(jié)果，因此做好提取樣品的質(zhì)控是第一步，也是最關(guān)鍵的一步。
應(yīng)用拓展
再說到最近這一年在新冠疫情當中，一開始核酸試劑檢測的假陰性問題引起了大家的關(guān)注，為什么會出現(xiàn)假陰性呢？是前期提取方法等問題造成核酸質(zhì)量過低可能存在檢測不到的問題!檢測方法并無不同，千差萬別的提取方法和試劑，造成了各家核酸檢測分析敏感性的差異。這里就可以看出核酸提取質(zhì)控的必要性了。因此我們在做rt-qPCR前，可以對提取的RNA的質(zhì)量進行質(zhì)控，提高確定樣本獲得準確的結(jié)果的可靠性，見下圖5，可以用Qsep系列檢測同一批次不同樣品提取的RNA，顯示了不同的RNA 樣本質(zhì)量。
圖5 不同質(zhì)量的RNA檢測圖
另外最近三代納米孔測序Nanopore 也是十分火爆，Nanopore 測序儀在微生物耐藥性以及致病性，環(huán)境研究，植物研究，癌癥研究，臨床研究，微生物組，轉(zhuǎn)錄組分析等領(lǐng)域都有大量的應(yīng)用。測序芯片中集成的是具有生物活性的納米孔蛋白，建庫過程十分簡單，因此想要獲取高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，前期的提取的質(zhì)量控制就特別重要。測序最長讀長可達2M，當然讀長還是要根據(jù)文庫實際的長度來決定。建庫之前可對樣品片段進行檢測確定下樣本質(zhì)量，選擇合適的打斷或者片段篩選方法。檢測結(jié)果如圖6所示，可以清晰看到整個樣本分布區(qū)間。
圖 6 不同質(zhì)量大片段樣本Qsep檢測圖
圖 7 不同質(zhì)量樣品在Nanopore測序儀上的讀長表現(xiàn)
如圖7所示，不同質(zhì)量的樣品構(gòu)建的文庫在測序讀長的表現(xiàn)相差較大，實際上樣品提取后純度以及長度，均會影響Nanopore測序的質(zhì)量，包括序列的準確度以及長度。因此對于要進行三代測序的各位實驗人員而言，前期對提取樣品的質(zhì)量控制十分重要。
那提取樣品的質(zhì)量控制如何進行呢?傳統(tǒng)上會對核酸的濃度、純度以及片段大小進行檢測，核酸濃度和純度一般通過qubit 和微量分光光度計進行檢測，這個標準相對比較常規(guī)，不再贅述。另外核酸的片段大小，正常是通過傳統(tǒng)的凝膠電泳進行檢測，操作相對比較繁瑣，另外需要人為判斷降解程度，并且需要一致的上樣量，染料量以及曝光度才有比較的意義。所以Qsep系列全自動毛細管電泳很好地解決了這個問題。讓提取樣品質(zhì)控變得從未如此簡單，它可以直觀展示樣品的片段大小及降解程度，并且搭配有定量試劑，可以直接檢測樣品濃度，初始樣品質(zhì)控一步到位，可以對樣本降解與否或片段分布的判斷給出統(tǒng)一的、可重復(fù)的評判標準，對后續(xù)實驗的穩(wěn)定和可重復(fù)性提供有力的保障。
圖 6 不同通量的Qsep系列全自動毛細管電泳儀
因此對于各種不同的分子生物學(xué)實驗而言，我們都推薦在初始的提取步驟把好質(zhì)控關(guān)，無論是簡單的PCR實驗，還是二代三代建庫測序，搭配Qsep 系列進行質(zhì)控和檢測，都是實驗人員優(yōu)質(zhì)的選擇!
參考文獻：[1] Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies[J]. Nature Biotechnology, 2017.
